ELISA中试剂:ELISA常用酶辣根过氧化酶(HRP)
ELISA(酶联免疫吸附试验)中,辣根过氧化酶(HRP)是常用的标记酶之一,因其的性质和广泛的应用优势而备受青睐。以下是关于HRP在ELISA中的主要特点和应用优势:
1. HRP的基本特性
分子结构:HRP是一种糖蛋白,由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉辅基组成,分子量约为40 kDa。
吸收特性:HRP在403 nm波长处有最大吸收峰,而去辅基的酶蛋白在275 nm波长处有最大吸收。
纯度与活性:HRP的纯度用RZ值表示,但RZ值仅反映血红素基团的含量,与酶活性无关。酶活性以单位(U)表示,即1分钟内将1 μmol底物转化为产物所需的酶量。
2. HRP的应用优势
稳定性高:HRP对热和有机溶剂较为稳定,易于保存和使用。
价格低廉:与碱性磷酸酶(AP)相比,HRP价格更低,且易于获得高纯度制剂。
标记效率高:HRP在酶标记物制备中得率较高,适合大规模应用。
底物多样性:HRP可催化多种底物,如四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)等,显色反应灵敏且稳定。
3. HRP在ELISA中的具体应用
检测流程:HRP通常作为二抗的标记酶,通过催化底物显色反应,将无色信号转化为显色产物,用于量化目标抗体水平。
底物选择:TMB是目前ELISA中常用的HRP底物,因其稳定性好、成色反应无需避光且无致突变作用。
反应终止:HRP的酶促反应可通过强酸或叠氮钠等终止剂有效终止。
4. HRP的保存与使用
保存条件:HRP在干燥状态下于-20°C可长期保持稳定,冷冻保存时需使用甘油、磷酸钠等基质溶液以维持其活性。
使用注意事项:避免使用叠氮钠作为防腐剂,因其可能抑制HRP活性。
综上所述,HRP因其高稳定性、低成本、高效标记和广泛底物适用性,成为ELISA中常用的标记酶之一。
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