elisa实验：直接 ELISA 操作步骤

　　直接 ELISA 操作步骤

　　常规程序

　　包被抗原

　　1. 用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后进行系列稀释。

　　样品纯度较高时通常在酶标板上稀释到不少于 2μg/ml。

　　不一定用纯化的溶液，不过，一般在试验样品中目的蛋白(抗原)含量需大于 3%。

　　抗原的蛋白浓度在酶标板上应该不高于 20μg/ml，此时已经足够中和酶标板上的位点了。

　　确保抗原的浓度在抗体可以检测到的范围内。

　　2.在酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。包被的孵育时间需要优化。

　　3.倒掉孵育溶液，用PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。 封闭

　　4. 用 200μl 含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。或者用其他封闭剂如 BlockACE、BSA (牛血清蛋白)代替。

　　5.用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。 6.用 PBS 洗板 2 次。

　　加抗体孵育

　　7.加入 100 μl 抗体，稀释到最佳浓度(参照说明书)，使用前用封闭液现配。

　　8. 用封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，该孵育时间需要进行优化。尽管 2 小时的孵育通常可以获得足够强的信号，但如果获得 的信号较弱时，通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。

　　9.用 PBS 洗板 4 次。

　　检测

　　10.用多通道吸液器向每孔加入 100μl(或 50μl)底物。

　　11.显示出足够深的颜色之后，再向每孔加终止液 100μl(如果必须)。 12.用酶标仪读每个孔的吸光度值(光密度)。

　　注意：一些酶作用物是有害的 ( 致癌物 )，因此必须小心操作并佩戴手套。

　　数据分析

　　根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，x 轴为浓度(对数转换)，y 轴为吸光度值(线性)。将样品吸光度值代入标准曲线求出 浓度。

　　3.夹心 ELISA

　　夹心 ELISA 用两种抗体协同测定抗原的含量(例如：捕获抗体和检测抗体)。抗原必须包含至少 2 个能被抗体识别的抗原位点才 能被检测，因为至少有 2 个抗体参与到这个试验中。

　　在夹心 ELISA 中，单克隆抗体和多克隆抗体都可以被用作捕获和检测抗体。单抗识别单一的抗原表位，可以区别抗原的微小差别 使抗原得到更精确地检测和定量。多克隆抗体通常被用作捕获抗体 , 以捕获尽可能多的抗原。

　　夹心 ELISA 的优势是样品在分析前不需要纯化 , 检测灵敏度高(灵敏度是直接法或间接法的 2-5 倍)。 注意事项：

　　夹心 ELISA 的步骤很难优化，试验中应使用测试过的配对抗体。这样可以确保在不干扰其他抗体结合的情况下，检测目标蛋白上 相应的不同抗原表位。因此对于没有做过特定测试试验的抗体，我们不能确保我们的抗体可以用于夹心 ELISA。请参阅抗体说明 书有关抗体测定应用的信息。

　　常规步骤：

　　包被捕获抗体

　　1. 用碳酸盐 / 重碳酸盐缓冲液 (pH7.4) 稀释捕获抗体至浓度 1-10μg/ml，包被酶标板。

　　如果使用了没有纯化的抗体(例如 : 腹水或抗血清)，可能需要通过提高样品蛋白浓度(试一下 10μg/ml)，

　　来补偿特定抗体数量较低的问题。

　　2. 用封口膜覆盖酶标板，于 4°C 孵育过夜。

　　3. 倒掉包被液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。 封闭和加样品

　　4. 封闭包被后孔内残留的蛋白结合位点 , 每孔加 200μl，含 5% 脱脂奶粉的 PBS 封闭液。

　　5. 用封口膜覆盖酶标板，室温孵育至少 1-2 小时或者如果方便的话，4°C 孵育过夜。

　　6. 每孔加 100μl 适当稀释的样品。在精确定量测定时，通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，每块板都要带标准(做 平行或者三 份)和空白对照以保证精确性。37°C 孵育 90 分钟。

　　对于定量检测，标准品的使用浓度应覆盖抗体结合的大部分动态检测范围。您可能需要优化标准品的浓度使用范围， 以确保得到一个合适的标准曲线。为了精确定量，样品和标准通常做 2 份或 3 份。

　　7. 倒掉样品 , 每孔用 200μl PBS 洗板 2 次。 用检测抗体和二抗先后进行孵育

　　8. 每孔加入 100μl 稀释好的检测抗体。

　　9. 用封口膜覆盖酶标板，室温孵育 2 小时。

　　10. 用 PBS 洗板 4 次。

　　11. 加入 100μl 标记二抗，使用前用封闭液快速稀释至最佳浓度(根据说明书)。

　　12. 用封口膜覆盖酶标板，室温孵育 1-2 小时。

　　13. 用 PBS 洗板 4 次。

　　检测

　　虽然许多种类的酶都可以用来检测，但辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 实验中是被广泛应用的两种酶。我们必 须要考虑到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性(例如肺泡细胞中高含量的 AP, 红血球中高含量的过氧化物酶)，这可能导致 不精确的结果。如果有必要的话，用左旋咪唑(针对 AP)或含 0.3% 双氧水溶液的甲醇(针对过氧化物酶)进行一个附加的封闭 处理。

　　天津天正信达供应：RNA开云体育手机版入口试剂盒、开云体育手机版入口试剂盒、PCR试剂盒 、提取试剂盒、色谱进样瓶、培养基瓶、试剂瓶、胎牛血清、染色液、试剂瓶、QPCR试剂盒、生物试剂、抗体、琼脂糖、实验耗材，我司拥有一支覆盖生物化学、分子生物学、免疫学等专业人员的研发、构建了仪器设备齐全的实验技术平台，主要包括AKTA、高压均质机、全波长酶标仪、高速落地离心机和qPCR仪等大型仪器设备。